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技術(shù)文章

ELISA測(cè)定植物組織
點(diǎn)擊次數(shù):983 更新時(shí)間:2016-09-05

游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物,其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。
分光光度計(jì);電子天平;容量瓶25ml或50ml 3個(gè);漏斗(直徑6厘米)3個(gè)、濾紙適量;20ml刻度試管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 支;試管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封試管口);吸水紙;擦鏡紙適量;電爐;水浴鍋(含鐵絲筐)。
.3%茚三酮試劑 稱3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到00ml容量瓶里,貯于棕色瓶中。此試劑應(yīng)放在冷涼處,不宜久放,使用期約0天。
2.氰酸鹽緩沖液(按以下方法配制):
()NaCN貯備液0.0mol/L(490mg/L)。
(2)醋酸緩沖液:稱360g醋酸鈉(含三分子結(jié)晶水)溶于約300ml無(wú)氨蒸餾水中,加66.67ml冰醋酸再用無(wú)氨蒸餾水稀釋至L。
取溶液()20ml,用溶液(2)定容到L。
3.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 稱取在80℃下烘干的3.mg(或α-8.9mg)溶于0%的異丙醇中,并在00ml容量瓶中用0%異丙醇稀釋至刻度,混勻,即為mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸貯備液,置冰箱中保存。為了制備工作液,可取貯備液與等量無(wú)氨蒸餾水混合,此液濃度為0.5mmol/L,即ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg。
4.95%乙醇;5.異丙醇(分析純)。
.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取20ml刻度試管8支,按下表5-加入各試劑。加完試劑后混勻,在00℃水浴中加熱2min(加熱時(shí)封口),取出在冷水中迅速冷卻,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛搖試管,使加熱時(shí)形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色,此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。于570nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度(以空白管為參比),以氨基酸濃度為橫坐標(biāo),光密度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出直線方程。
2.樣品提取 選取有代表性的植物葉片(或其它組織),洗凈擦干,剪碎混勻,迅速稱取0.0~0.20g(視氨基酸含量多少而定),共稱3份,分別加入20ml刻度試管中,再加蒸餾水0ml蓋塞(或系上塑料薄膜),置沸水浴中20min以提取游離氨基酸,到時(shí)取出在自來(lái)水中冷卻,把上清液濾入25ml容量瓶中,之后再往試管中加5ml蒸餾水,置沸水浴上再加熱0min,過(guò)濾并反復(fù)沖洗殘?jiān)?,zui后定容至刻度,搖勻。
3.樣品測(cè)定 另取4支潔凈干燥的試管,其中3支分別加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸餾水,然后在上述4支試管中分別加入NaCN緩沖液、水合茚三酮各0.5ml,加完試劑后蓋塞,置沸水浴上加熱2min,冷卻后,再分別加5ml 95%乙醇,搖勻,以空白作參比,在波長(zhǎng)570nm下測(cè)其光密度。

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